細(xì)胞污染的來源

關(guān)于細(xì)胞污染的一些總結(jié)和心得

概述：凡混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染，細(xì)胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性。細(xì)胞污染根據(jù)污染源主要可以分為物理性，化學(xué)性和生物性污染。

物理性污染的來源、危害及預(yù)防：物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染。物理性污染通過影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細(xì)胞的代謝。培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫 度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細(xì)胞產(chǎn)生影響。細(xì)胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改變，如細(xì)胞同步化、細(xì)胞生長受抑制甚至細(xì)胞死亡。通過實驗室 的合理設(shè)計及建立規(guī)范的操作規(guī)程，可以減少環(huán)境中物理因素對細(xì)胞的影響。孵箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機(jī)械振動的設(shè)備，如離心機(jī)。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時間后再進(jìn)行實驗，以避免過冷的溫度對細(xì)胞的影響。

化學(xué)性污染的來源、危害及預(yù)防 ：培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染 。化學(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長，某些化學(xué)物質(zhì)如**就可促進(jìn)細(xì)胞的生長。不同細(xì)胞對化學(xué)物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生 長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來源。細(xì)胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸，若濃度超過了合適的范圍，也會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細(xì)胞系 其*佳培養(yǎng)條件下對血清和緩沖液的要**不一樣的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴(yán)格控制。玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂(通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面)是*常見的化學(xué)性污染。水是**一種在凝固時 膨脹的化合物。因此在選擇凍存細(xì)胞的容器時應(yīng)考慮到這個因素。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要原因。為了避免金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)胞內(nèi)**等物質(zhì)對水的污染，在配制液體，清洗容器時必須使用不含雜質(zhì)的超純水 。需要注意的是，超純水放置過久其純度會下降。在高壓蒸氣**及蒸餾水時水經(jīng)常被污染，因為高壓蒸氣鍋及純水機(jī)的常規(guī)維護(hù)后可能有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留。為 了保證水的純度，我們應(yīng)采取措施盡量避免化學(xué)物質(zhì)的殘留。動物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基，但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來源。由于血清采集于多個動物，而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同，因此血 清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細(xì)胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能、組織來源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進(jìn)行一系列實驗 時，為了保證實驗的可重復(fù)性，*好選用同一批次的血清。培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑 培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學(xué)性污染的來源。細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過權(quán)威機(jī)構(gòu)的鑒定，實驗者本人也應(yīng)對上述成分進(jìn)行 純度鑒定。同時，正確配置和儲存培養(yǎng)液及試劑也是非常重要的，應(yīng)該采取標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，避免液體體積計算錯誤，混用類似化合物等錯誤。

器皿及容器 細(xì)胞培養(yǎng)過程中會使用到各種不同的培養(yǎng)器皿及容器。培養(yǎng)器皿的大小，構(gòu)形設(shè)計可能會影響到培養(yǎng)中氣體交換、濕度、培養(yǎng)液的pH值和細(xì)胞生長密度。培養(yǎng)器 皿的工藝及**過程中的差異可能對培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響。塑料制品在生產(chǎn)過程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。儲存 不同物質(zhì)時應(yīng)選用合適的塑料或玻璃容器，因為酒精、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。

微生物污染

由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而在培養(yǎng)基中加***的抗污染能力也是有限的，因而細(xì)胞微生物污染一旦發(fā)生往往是無法挽救的。一般在細(xì)胞受到污染早期或污染較輕時，能及時處理并除去污染物，部分細(xì)胞還有可能得到挽救。但當(dāng)細(xì)胞持續(xù)在污染環(huán)境中生長時，輕者細(xì)胞生長緩慢，分裂相減少，細(xì)胞變得粗糙，輪廓增強(qiáng)，胞漿中出現(xiàn)較多的顆粒物質(zhì)；較重的細(xì)胞增殖停止，分裂相消失，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。

不同的微生物污染物對細(xì)胞的影響也有差別，微生物中支原體和病毒對細(xì)胞形態(tài)和技能的影響是長期的，緩慢的和潛在的。而霉菌和**增殖迅速，能在很短的時間內(nèi)抑制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞。

霉菌污染

表現(xiàn)：**的種類很多，污染的多是曲霉菌，白色***，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成淡黃色或是白色的漂浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不變混濁。倒置顯微鏡下可以看見細(xì)胞之間有縱橫交錯穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲，并漂浮在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡下可以看見鏈狀排列的菌株。***及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長。有時通過顯微鏡可能會發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)瓶外壁生長的菌絲，較易誤認(rèn)為污染。發(fā)現(xiàn)瓶外的菌絲后應(yīng)及時用酒精擦拭干凈。

處理：首先，需確定污染物是**、**、支原體，還是酵母?，F(xiàn)在你確認(rèn)是霉菌污染。因此，盡快把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，同時需要對實驗過程中所用的器材和試劑做處理。

一般來說，高濃度的***和抗霉菌素都可能對細(xì)胞或細(xì)胞系有毒性作用，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定***和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用***如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。

下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1)在無***的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

2)分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇***加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3)每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4)確定***毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的***的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代。

5)在無***的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

6)重復(fù)步驟4。

7)在無***的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代，確定污染