細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

一般進(jìn)實(shí)驗(yàn)室都有師兄師姐帶著做，他們就是你做細(xì)胞的啟蒙老師。他們的操作手法、細(xì)節(jié)、理論講解就成了你操作的準(zhǔn)則，如營養(yǎng)液、細(xì)胞瓶的擺放位置；**處理程序；開蓋手法；細(xì)胞吹**法等等。要學(xué)會他們的正確操作，在**次的時候就要重視。

細(xì)胞真的很脆弱，*好每天都去看看它，以防止出現(xiàn)培養(yǎng)箱缺水、缺二氧化碳、停電、溫度不夠等異?，F(xiàn)象，也好及時解決這些意外，避免重復(fù)實(shí)驗(yàn)帶來的更大痛苦。

細(xì)胞要分批傳代，這樣即使有一批出了問題，還有一批備用的。像后者一般人可能不容易做到。但這是我血的教訓(xùn)，有一次細(xì)胞污染了，全軍覆沒。當(dāng)時可后悔沒有保種。

細(xì)胞跟人一樣，不同的細(xì)胞，培養(yǎng)特性是不一樣的。培養(yǎng)過程中要細(xì)細(xì)體會。不同細(xì)胞株使用不同的培養(yǎng)基和血清。

如我養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞很活躍，喜歡熱鬧，2~3 天就好多人口，而且不太愛吃喝，真是*好養(yǎng)的孩子了。內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞性格相近，不過它很不講衛(wèi)生，也很邋遢，里面有很多分泌屋，要經(jīng)常換洗才行。RAW264.7 細(xì)胞也很開朗，而且很能吃，要經(jīng)常喂它，頭疼的是細(xì)胞很容易活化，培養(yǎng)它的瓶子和環(huán)境沒有內(nèi)**才好，不過我這個當(dāng)媽的很難滿足它了。

包括耗材的處理、試劑的配置，無菌檢驗(yàn)等等。

• 玻璃器皿的清洗。對于玻璃器皿（細(xì)胞瓶、裝營養(yǎng)液的瓶子、小青霉素瓶等）要先用洗衣粉刷干凈（注意死角），然后沖干凈。用酸液浸泡 24 h 以上，之后用清水沖洗 10 遍，除去殘留酸液。瓶子之類，沖洗過程要使勁搖晃。然后在雙蒸水浸泡 24 h。晾干后包扎，160℃ 干烤 2 h 待用。

• 試劑配置。細(xì)胞培養(yǎng)用的液體一般使用雙蒸以上的水即可。并注意 pH 值的調(diào)節(jié)。

• 無菌檢驗(yàn)。主要采用過濾**：如胰酶、***、G-418 溶液、各類培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、谷氨酰胺等。有些可以采用高壓**：如 PBS、D-Hank's等。

包括營養(yǎng)液、胰酶、血清等。

血清特別重要。血清必須貯存于 –20℃，如果一次無法用完一瓶，可將 40～50ml 分裝于無菌酸處理瓶中，甚至置青霉素瓶保存。一般廠商提供的血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。（一般情況下不影響細(xì)胞培養(yǎng)）

瓶裝血清一定要逐步解凍: 4℃ 冰箱全溶后再分裝，在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。

熱滅活是指 56℃，30 分鐘加熱已完全解凍之血清。水浴鍋升到 56℃后，將血清放入，待溫度升高到 56℃ 后計(jì)時，一般 5 分鐘左右規(guī)則搖晃均勻一次。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份去活化。除非必須，一般不要作此熱處理，因?yàn)闀斐沙恋砦镏@著增多，且會影響血清之品質(zhì)。注意更換新血清（包括不同批次）對細(xì)胞的影響。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，超凈臺以紫外燈照射 30 分鐘**，以 70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟超凈工作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)數(shù)分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。

每次操作只處理一株細(xì)胞株，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺，以 70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。

無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如支架、吸管等公用物品可以暫時放置，其它個人實(shí)驗(yàn)用品用完應(yīng)立即拿出。實(shí)驗(yàn)用品以 70% 乙醇擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在中央無菌區(qū)域，一般勿在邊緣區(qū)域操作。

小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約 45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

不同的細(xì)胞可能培養(yǎng)基不同，甚至不同的文獻(xiàn)可能對相同的細(xì)胞培養(yǎng)基成分也是可能不同的。如我當(dāng)時培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，有文獻(xiàn)就選用 neurobase 培養(yǎng)基，而我的實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹饕亲隹寡趸脱趸矫娴?，而這種培養(yǎng)基中含有抗氧化劑成分，此時，我就不得不選擇另外一種不含抗氧化劑的培養(yǎng)基。