人連蛋白(Zonulin)試劑盒
使用說明書
人連蛋白(Zonulin)試劑盒基本原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗人Zonulin抗體包被于酶標板上，實驗時樣品或標準品中的人Zonulin與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人Zonulin抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素?？谷薢onulin抗體與結(jié)合在包被抗體上的人Zonulin結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成**復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測OD值，人Zonulin濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中人Zonulin的濃度。
人連蛋白(Zonulin)試劑盒描述:
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英文名稱
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Human Zonulin ELISA Kit
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中文名稱
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人連蛋白(Zonulin)酶聯(lián)**吸附測定試劑盒
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貨號
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X-EL-H5560c
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種屬
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Human/人
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規(guī)格
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96T/Kit (8*12 strips) 48T/Kit (8*6 strips)
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檢測方法
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雙抗體夾心法
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檢測范圍
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0.781~50ng/mL
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靈敏度
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0.469ng/mL
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人連蛋白(Zonulin)試劑盒組成：
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中文名稱
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英文名稱
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規(guī)格
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保存
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ELISA酶標板（可拆卸）
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Micro ELISA
Plate(Dismountable)
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8×12 / 8×6*
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4℃/-20℃ #
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凍干標準品
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Reference Standard
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2/1 支*
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4℃/-20℃ #
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標準品&樣品稀釋液
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Reference Standard &
Sample Diluent
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1瓶 20mL/12mL*
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4℃
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濃縮生物素化抗體
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Concentrated Biotinylated
Detection Ab
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1支 120μL/70μL*
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4℃/-20℃ #
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生物素化抗體稀釋液
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Biotinytated Detection Ab
Diluent
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃
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濃縮HRP酶結(jié)合物
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Concentrated HRP Conjugate
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1支 120μL/70μL*
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4℃(避光)
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酶結(jié)合物稀釋液
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HRP Conjugate Diluent
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃
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濃縮洗滌液（25×）
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ConcentratedWashBuffer
(25×)
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1瓶 30mL/16mL*
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4℃
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底物溶液（TMB）
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Substrate Reagent
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃(避光)
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反應(yīng)終止液
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Stop Solution
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃
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封板覆膜
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Plate Sealer
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5/3 張*
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產(chǎn)品說明書
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Product Description
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1 份
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質(zhì)檢報告
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Certificate of Analysis
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1 份
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特別說明：
*: [96T/48T]（打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整）
#: 一周內(nèi)使用可存于4℃，需長時間存放或多次使用建議存于-20℃.
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人連蛋白(Zonulin)試劑盒檢測前準備工作:
1. 請?zhí)崆?/span>20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應(yīng)為室溫）。當日使用。
3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為8000pg/mL）。然后根據(jù)需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：按照稀釋方法圖例 標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL標準品：取0.5mL10ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。
4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當日使用。
5. 酶結(jié)合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。
當日使用。
人連蛋白(Zonulin)試劑盒標準品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實際用量來稀釋，如200μL/管）
1. 在各孔中加入標準品或樣品各100μL， 37℃孵育90分鐘
2. 加入100μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育60分鐘
3. 洗滌3次
4. 加入100μL酶結(jié)合物工作液， 37℃孵育30分鐘
5. 洗滌5次
6. 加入90μL底物溶液， 37℃孵育15分鐘左右
7. 加入50μL終止液，立即在450nm波長處測量OD值
8. 結(jié)果計算
一、操作因素對ELISA結(jié)果的影響ELISA操作步驟復(fù)雜，操作不當將引起較大的誤差。以下敘述各個步驟中的影響因素。
1.加樣
2.溫育
3.洗滌
4.顯色
5.比色
二、灰區(qū)的設(shè)置通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性”和“陰性”來報告結(jié)果，兩者間有一條分界線被稱為“陽性判斷值”（cut-off value，CO值），這是定性**測定結(jié)果報告的依據(jù)。
三、標本復(fù)查ELISA手工檢測過程復(fù)雜，影響因素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成結(jié)果的差異，因此加大復(fù)查力度是保證結(jié)果準確性的可靠方法，比如對HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項目的可疑、弱陽性標本及少見模式的檢測結(jié)果進行復(fù)查。
四、結(jié)果判斷和報告常用下列幾種方法表示結(jié)果：
1.定性測定
2.半定量測定 結(jié)果一般以滴度表示。
3.定量測定 即用已知量的標準品作一系列稀釋后進行ELISA測定，繪制標準曲線，結(jié)果以**量或單位表示。在ELISA定量檢測中每一塊反應(yīng)板都必須繪制相應(yīng)的標準曲線。
注意事項：
A 仔細閱讀說明書。
B 檢查試劑盒標簽上的有效期。如果超過有效期，請勿使用。
C 按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）。
D 標本制備要規(guī)范，每份標本體積要按2-3個復(fù)孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內(nèi)無法實驗者，注意低溫保存。
E 準備好所有實驗額外所需物品，（比如移液器，試管，清洗器，酶標儀）。
F 按說明書將所用試劑平衡至室溫，根據(jù)檢測標本數(shù)量確定所需試劑的量。
G 檢查試劑盒內(nèi)每種試劑的貯存條件，保證所有試劑均按照試劑盒內(nèi)說明書推薦的條件存儲。
H 檢查不穩(wěn)定或者變質(zhì)的試劑溶液（比如沉淀或變色）。有些試劑，比如標準品稀釋液或者檢測稀釋液，可能在設(shè)計時就含有沉淀物。所有試劑在滴入酶標板之前，必需充分混勻。而由于沉淀物的特性，在加入酶標板之前，必需不停攪拌。
I 保證充分的孵育時間和溫度。
J 切勿使用不同生產(chǎn)批號的試劑取代現(xiàn)有試劑或混合現(xiàn)有試劑。
K 在混合或溶解蛋白溶液時，避免泡沫產(chǎn)生。
L 在實驗開始之前，安排好實驗流程。
M 在實驗開始之前，清潔工作臺。
N 若有問題，應(yīng)與我公司或代理商的技術(shù)支持聯(lián)系
結(jié)果判斷:
1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計算。以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪出標準曲線。
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
3. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
人連蛋白(Zonulin)試劑盒有效期穩(wěn)定性考察
本試驗以連蛋白(Zonulin)為例
1. OD值：
正常保存條件下有效期內(nèi)和超過有效期2個月所測OD值比較
正常有效期內(nèi)OD值： 3.251，2.845，2.126, 1.859, 1.463, 1.022, 0.710,
0.08
超過2個月有效期OD值：3.1.7, 2.643, 2.125, 1.796, 1.453, 0.876, 0.432, 0.07
2.回收率：分別于定值血清及血漿中加入一定量的連蛋白(Zonulin)標準品，重復(fù)測定并計算其品均值，回收率為測定值與理論值的比率。
正常保存條件下有效期內(nèi)和過有效期2個月elisa 試劑盒回收率檢測結(jié)果
|
Sample
|
Conditions
|
Recovery range(%)
|
Average(%)
|
|
Serum(n=6)
|
normal
|
88-106
|
95
|
|
After 12 month
|
80-100
|
87
|
|
EDTA plasma(n=6)
|
normal
|
88-106
|
97
|
|
After 12 month
|
78-98
|
87
|
3. 線性：分別于定值血清及血漿中加入一定量的連蛋白(Zonulin)標準品，并將標本按1:2,1:4,1:8稀釋，線性范圍即為稀釋后樣本中連蛋白(Zonulin)含量的測定值與理論值的比率。
正常保存條件下有效期內(nèi)和過有效期2個月elisa 試劑盒回線性檢測結(jié)果
|
Sample
|
Conditions
|
1:2
|
1:4
|
1:8
|
|
Serum(n=6)
|
normal
|
81-92%
|
85-90%
|
89-105%
|
|
After 12month
|
80-88%
|
82-87%
|
87-101%
|
|
EDTA plasma(n=6)
|
normal
|
93-104%
|
81-97%
|
91-96%
|
|
After 12month
|
82-95%
|
75-82%
|
74-90%
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4. 精密度：以樣品測定值的變異系數(shù)CV表示。CV（%）=SD/meanx100
批內(nèi)差：取同一批次試劑盒對低值，中值和高值樣本進行定量檢測，每份樣本測定20次，分別計算不同濃度樣本的平均值和SD值。
批間差：選取 3 個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進行定量測定， 每個樣本使用同一試劑盒重復(fù)測定 8 次，分別計算不同濃度樣本的平均值及 SD 值。(批內(nèi)差： CV<10%;批間差： CV<11%)
正常保存條件下有效期內(nèi)和過有效期2個月elisa 試劑盒回精密度檢測結(jié)果
Intra-assay precision
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Conditions
|
normal
|
After 12month
|
normal
|
After 12month
|
normal
|
After 12month
|
|
sample
|
1
|
1
|
2
|
2
|
3
|
3
|
|
n
|
20
|
20
|
20
|
20
|
20
|
20
|
|
Mean(ng/ml)
|
16.68
|
14.22
|
70.25
|
62.36
|
369.75
|
327.88
|
|
SD
|
1.08
|
1.25
|
4.21
|
5.31
|
24.69
|
32.87
|
|
CV(%)
|
6.5
|
8.8
|
6.0
|
8.5
|
6.6
|
10
|
|
Conditions
|
normal
|
After 12month
|
normal
|
After 12month
|
normal
|
After 12month
|
|
Sample
|
1
|
1
|
2
|
2
|
3
|
3
|
|
n
|
20
|
20
|
20
|
20
|
20
|
20
|
|
Mean(ng/ml)
|
18.72
|
13.68
|
65.98
|
61.25
|
387.22
|
425.26
|
|
SD
|
1.45
|
1.52
|
4.83
|
5.18
|
28.49
|
36.87
|
|
CV（%）
|
7.7
|
11.1
|
7.3
|
8.5
|
7.3
|
8.7
|
人連蛋白(Zonulin)試劑盒會出現(xiàn)的問題及解決辦法：
1. 加入反應(yīng)終止液后，沒有吸光值或吸光值偏低。
a.原因：未加入酶標記物。
解決辦法：請按照操作步驟進行。
b.原因：試劑盒內(nèi)容物未能充分回。
解決辦法：確定試劑盒內(nèi)容物回溫后再進行操作。
c.原因：室溫太低。
解決辦法：若室溫太低(<19℃)，請于操作步驟4，適當延長溫育時間。
d.原因：未使用試劑盒的清洗液清洗。
解決辦法： 請用試劑盒內(nèi)所提供的清洗液清洗。
e.原因：試劑盒已過有效期限。
解決辦法：請更換成仍在有效期限內(nèi)的試劑盒。
2. 標準曲線線性不佳，或是平行性不好。
a.原因：溫育位置避光不好或受到氣流干擾。
解決辦法： 請確認溫育位置既不透光也不透風(如抽屜內(nèi))。
b.原因：操作時間拖太久。
解決辦法：請在方法熟練后再進行操作。
c.原因：微孔間相互污染。
解決辦法： 加樣品時，請小心勿濺出微孔外，以免造成其它微孔的污染。
d.原因：標準品或酶標記物所加入的量不一致。
解決辦法：請使用已校正過的移液槍，并確保其與吸頭之間有高度密合性。
e.原因：添加樣品或試劑的操作方法不正確。
解決辦法：加樣品或試劑時，吸頭請勿接觸微孔。
f.原因：洗板過程發(fā)生問題(如管路堵塞、洗完板后未立刻進行下一步驟)。
解決辦法：請隨時監(jiān)控洗板機洗板過程，洗完后立即進行下一步驟。
3. 吸光值均偏高(或線性不夠陡)。
a.原因：室溫太高(>25℃)。
解決辦法： 若無法降低室內(nèi)溫度，請適當縮短步驟4的溫育時間。
b.原因：底物溶液受到污染。
解決辦法： 若發(fā)現(xiàn)底物溶液已呈現(xiàn)淡藍色，請不要再使用。
c.原因：反應(yīng)時間超過太久。
解決辦法：請控制反應(yīng)時間。
d.原因：酶標記物污染了盒內(nèi)其它試劑。
解決辦法：使用過的吸頭應(yīng)立即丟棄，可避免試劑間相互污染，凡是試劑(特別是酶標記物與底物溶液)接觸過的容器應(yīng)立即清洗干凈。(先以漂白水浸泡，再以清水沖洗干凈，可確保無殘留)
4. 陰性標準品的吸光值低于陽性標準品的吸光值。
a.原因：微孔中的試劑未能充分混合。
解決辦法： 試劑加完后，需輕敲盤四周使其充分混合均勻。
b.原因：洗板過程發(fā)生問題(同2-f.)。
解決辦法：請參考2-f.
c.原因：添加樣品或酶標記物的量不一致。
解決辦法： 請參考2-d.