【簡(jiǎn)介】

      紅霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類***，主要用于抗畜禽**及支原體感染，亦可作豬的飼料添加劑以促進(jìn)增重和提高飼料轉(zhuǎn)換率。農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件中規(guī)定，該**的*高殘留限量為100ug/kg。本試劑盒是應(yīng)用ELISA 技術(shù)研發(fā)的新一代**殘留檢測(cè)產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)。

紅霉素試劑盒【原理】

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物紅霉素與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)其抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含蘇丹紅的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出殘留物紅霉素的含量。

【適用范圍】

      適用于檢測(cè)動(dòng)物組織（肌肉、肝臟、雞肉、水產(chǎn)）蜂蜜、牛奶等樣本中紅霉素類**的殘留量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】  

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測(cè)時(shí)間： 75min

樣本檢測(cè)下限：

組織…………………………………………… 4ppb

蜂蜜…………………………………………… 4ppb

牛奶 ……………………………………………4ppb

樣本回收率

組織……………………………………80% ±10%

蜂蜜……………………………………80% ±10%

牛奶 ……………………………………85% ±10%

紅霉素試劑盒交叉反應(yīng)率

紅霉素………………………………………100%

硫氫酸紅霉素………………………………105%

琥乙紅霉素………………………………… 85%

【試劑盒組成】  

1、微量測(cè)試孔：每條8孔，一板12條

2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1 ppb、 0.3 ppb、 0.9ppb、2.7ppb、8.1 ppb

3、酶標(biāo)記物      12ml………………………………紅色帽

4、抗體工作液    7ml………………………………綠色帽

5、底物液 A液    7ml………………………………棕色帽

6、底物液 B液   7ml……………………………… 黑色帽

7、終 止 液       7ml……………………………… 黃色帽

8、20X濃縮洗滌液  40ml…………………………白色帽

9、2X濃縮復(fù)溶液   50ml…………………………藍(lán)色帽

【所用儀器、試劑】  

儀          器：微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：?jiǎn)蔚?nbsp;20μl～200μl、100μl～1000μl、多道 250μl

試           劑：甲醇

紅霉素試劑盒【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、樣品提取液：70%甲醇溶液30ml蒸餾水或去離子水和70ml純甲醇混合制備70％甲醇溶液。

配液2、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的稀釋。

配液3、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】  

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

u 樣本處理方法：

（a）組織樣本前處理方法

1、 稱取1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于離心管中，加入4ml樣品提取液，振蕩5min，室溫4000r/min 以上，離心10min；

2、 取1ml上清液收集于另一試管中;加入1ml 正己烷, 振蕩1min，室溫4000r/min 以上，離心10min；

3、  取50 μl下層液體于另一容器中，加入450μl樣本稀釋液，混合30s；

4、 取50 μl 用于分析

    樣本稀釋倍數(shù): 40 倍

（b）蜂蜜處理方法

1、 準(zhǔn)確稱取1±0.05g 蜂蜜樣本于離心管中，加入4ml 樣品提取液，強(qiáng)烈混合振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；

2、 取出50μl 上清液于另一試管中，加入450μl樣本稀釋液，混合30s；

3、 取50 μl 用于分析

樣本稀釋倍數(shù): 40 倍

（c）牛奶樣品處理方法

脫脂牛奶

1、取出50μl 脫脂牛奶于另一試管中，加入1950μl樣本稀釋液，混合30s；

2、取50 μl 用于分析

脂肪奶

3、確吸取1ml 牛奶樣本于離心管中；于15℃環(huán)境3000r/min，離心10min；（如果沒(méi)有冷凍離心機(jī)請(qǐng)預(yù)先冷卻后再離心)

4、取出50μl 牛奶于另一試管中，加入1950μl樣本稀釋液，混合30s；

5、取50 μl 用于分析

   樣本稀釋倍數(shù): 40 倍

紅霉素試劑盒【酶標(biāo)**分析程序】  

操作步驟：

1、      從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、      取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、      編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、      加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

5、      取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250μl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的

           槍頭刺破）。

6、      每孔加入酶標(biāo)記物100μl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。重復(fù)步驟6。

7、      顯色：每孔加入底物液A液50μl， 再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、      測(cè)定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)

           據(jù)），測(cè)定每孔OD值。

【結(jié)果判定】  

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含紅霉素成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.610；0.1ppb為1.350；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.720； 2.7ppb為0.359；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中紅霉素實(shí)際含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以**個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以蘇丹紅濃度（ng /ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中紅霉素實(shí)際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來(lái)電索?。?b>  

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線

B/B0 (%)

                    紅霉素(ppb) [μg/kg]

             圖1：紅霉素檢測(cè)試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性

%CV

紅霉素(ppb) [μg/kg]

            圖2：紅霉素檢測(cè)試劑盒的精密度

  由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出紅霉素檢測(cè)試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對(duì)相應(yīng)蘇丹紅濃度作曲線，可以看到全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】  

1、      使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、      在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行

          下一步操作。

3、      混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、      反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、      不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、      不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、      顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、      該試劑盒*佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲(chǔ)存】

 原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

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