頭孢類（三合一）試劑盒
產(chǎn)品介紹
一、概要
頭孢類**是一種廣譜的***，具有優(yōu)良的**活性和藥動學(xué)特點(diǎn)，對許多革蘭氏陽性和革蘭氏陰性及產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的**有效。頭孢類**是采用破壞**細(xì)胞壁的方式殺死**。由于目前使用的檢測分析法樣本前處理及測定操作繁瑣且費(fèi)用較高，使推廣應(yīng)用受到限制。
本試劑盒是應(yīng)用 ELISA 技術(shù)研發(fā)的新一代**殘留檢測產(chǎn)品，操作時(shí)間僅需 1.5 小時(shí)，能*大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。
二、頭孢類（三合一）試劑盒試驗(yàn)原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的頭孢噻呋、頭孢曲松、頭孢噻肟和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗三者的抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物頭孢類**的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中頭孢類**的殘留量。
三、適用范圍
可定性、定量檢測動物組織（肌肉、水產(chǎn)）和牛奶樣本中頭孢噻呋、頭孢曲松、頭孢噻肟的殘留量。
四、交叉反應(yīng)率
頭孢噻呋 ……………………………………………100%
頭孢曲松………………………………………………130%
頭孢噻肟……………………………………………73%
頭孢唑啉…………………………………………小于 0.1%
五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑
設(shè)備：
┅┅微孔板酶標(biāo)儀 450/630nm
┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置
┅┅振蕩器
┅┅渦旋儀
┅┅離心機(jī)
┅┅天平：感量 0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅洗耳球
┅┅容量瓶：500ml
┅┅聚苯乙烯離心管： 2ml、50ml
┅┅微量移液器：單道 20～200μl、100～1000μl、多道 250μl
試劑：
----濃鹽酸（分析純）
----乙腈(分析純)
----正已烷(分析純)
----去離子水
六、頭孢類（三合一）試劑盒提供的材料與試劑
1、96 孔酶標(biāo)板×1 塊 （包被有偶聯(lián)抗原）
2、標(biāo)準(zhǔn)品×6 瓶：（1ml/瓶）0ppb，0.5ppb，1.5ppb，4.5ppb，13.5ppb，40.5ppb
3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：（1ml/瓶） 1ppm：
4、酶標(biāo)二抗 12ml…………………紅色帽
5、抗體工作液 7ml…………………綠色帽
6、底物液 A 液 7ml…………………白色帽
7、底物液 B 液 7ml…………………紅色帽
8、終 止 液 7ml…………………黃色帽
9、20×濃縮洗滌液 40ml…………………透明帽
10、2×濃縮復(fù)溶液 50ml…………………藍(lán)色帽
七、頭孢類（三合一）試劑盒溶液的配制
配液 1: 0.05 M 鹽酸溶液量取 2.1ml 濃鹽酸加入去離子水中定容至500ml，混勻。
配液 2: 提取工作液量取 80ml 乙腈加入 20ml 0.05M 鹽酸中，混勻。
配液 3: 復(fù)溶工作液用去離子水將 2×濃縮復(fù)溶液按 1：1 體積比進(jìn)行稀釋（1 份 2×濃縮復(fù)溶液+1 份去離子水）用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在 4℃（39.2℉）環(huán)境可保存一個月。
配液 4: 洗滌工作液用去離子水將 20×濃縮洗滌液按 1：19 體積比進(jìn)行稀釋（1 份 20×濃縮洗滌液+19 份去離子水用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在 4℃（39.2℉）
環(huán)境可保存一個月。
八、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時(shí)，都必須注意：
（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否潔凈，必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（c）未處理的樣本需冷凍環(huán)境保存。
（d）處理好的樣本應(yīng)立即用于檢測，不易保存。
（一）動物組織（雞肉、豬肉、牛肉、魚、蝦）樣本前處理方法
-----稱取 2.0±0.05g均質(zhì)后的組織樣本至 50ml 聚苯乙烯離心管中，加入 8ml 提取工作液（見配液 2），用振蕩器振蕩 5min，3000g離心 5min；
----移取 1ml 上清至 10ml 潔凈干燥玻璃試管中， 50-60℃于（122-140℉）水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?
----加入 1ml 正己烷，用渦旋儀渦動 30s 溶解干燥殘留物，再加入 1ml 復(fù)溶工作液（見配液 3）用渦旋儀渦動 30s，3000g離心 5min；
-----除去上層有機(jī)相，取下層水相 50μl 用于分析。
（二）牛奶樣本處理方法
----移取 100μl 鮮牛奶至 2ml 離心管中，再加入 900μl 復(fù)溶工作液（見配液 3），混勻。
----取 50μl 用于分析。
九、頭孢類（三合一）試劑盒檢測步驟
測定前應(yīng)須知：
1、使用之前將模具內(nèi)所有試劑與酶標(biāo)板放實(shí)驗(yàn)桌回溫至室溫（20-25℃/68-77℉）。
2、使用之后立即將所有試劑放回 2-8℃(36-46℉)。
3、在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點(diǎn)。
4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
操作步驟：
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，按照上述方法進(jìn)行回溫，注意每種液體試劑使用前均需搖勻。
2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放回鋁箔袋重新真空密封，保存于 2-8℃（36-46℉）環(huán)境中。
3、濃縮洗滌液和濃縮復(fù)溶液使用前也需按上述方法回溫。
4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本和抗體工作液：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50μl 到對應(yīng)的微孔中，然后加入抗體工作液 50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置 4-8℃（36-46℉）避光環(huán)境中反應(yīng) 30min。
6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（見配液 4）250μl/孔，充分洗滌 4－5 次，每次間隔 10s，潑掉板孔內(nèi)洗滌液，用吸水紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
7、加酶標(biāo)二抗：加入酶標(biāo)二抗 100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃（77℉）避光環(huán)境中反應(yīng)30min，取出重復(fù)洗板步驟 6。
8、顯色：加入底物液 A 液 50μl/孔，再加入底物液 B 液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，25℃置（77℉）環(huán)境中反應(yīng) 15min（見注意事項(xiàng) 8）。
9、測定：加入終止液 50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630nm 檢測，請?jiān)?min 內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔 OD 值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。
十、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含頭孢三合一的含量成負(fù)相關(guān)。
1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.110， 樣本 2 的吸光度值為 0.820， 標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值分別是：0ppb 為1.880；0.5ppb 為 1.360；1.5ppb 為 0.986；4.5ppb 為 0.509；13.5ppb 為 0.190；40.5ppb 為 0.079。則樣本 1 的濃度范圍是 13.5ppb-40.5ppb 再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中頭孢類**殘留的濃度范圍；樣本 2 的濃度范圍是1.5ppb-4.5ppb 再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中頭孢類**殘留的濃度范圍。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以**個標(biāo)準(zhǔn)品（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值的平均值，再乘以 100%，
即百分吸光率（%）＝B/ B0 ×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以頭孢三合一標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中頭孢三合一的實(shí)際濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?
十一、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
試劑盒靈敏度：0.5ppb
樣本*低檢測限：
動物組織………………………………………2ppb
牛 奶 …… …… … …… …… … …… …… …… … …5 p p b
準(zhǔn)確度：
動物組織（雞肉、豬肉、牛肉）………75% ±10%
動物組織（魚 、蝦）……………………… 70%±1 0%
牛奶 …………………………………… 90% ±10%
精密度：
試劑盒的板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于 10%。
十二、注意事項(xiàng)
1、室溫低于20℃（68℉）或試劑及樣本的溫度沒有回到室溫（20-25℃/68-77℉）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、每加一種試劑前需將其搖勻。
4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用超出有效期的試劑盒；也不要使用超出有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用超出有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、儲存條件保存試劑盒于 2-8℃（36-46℉），不要冷凍，將不用的微孔板放回鋁箔袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0 標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于 0.5 （A450nm<0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8、在加入底物液 A 液和底物液 B 液后，一般顯色時(shí)間為15min 即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時(shí)間到 20min（或更長），但不得超過 25min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。
十三、貯藏條件及保存期
貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃（36-46℉）環(huán)境中。
保 存 期：有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。