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1. 估算組織細(xì)胞的用量。每次微量提取一般需要100-200 mg植物葉片、或50-100 mg植物種子、或200-500 mg植物果實(shí)。
2. 樣品破碎：
1) 勻漿法：先將新鮮植物組織剪切成小塊(保存在RNALOCKER中的植物組織需用紙吸去RNALOCKER液體后再剪切成小塊)，放入10-15 mL塑料離心管中，加入1 mL溶液A，然后用勻漿器勻漿5-20秒。勻漿時(shí)會(huì)產(chǎn)生泡沫，但不影響提取效果。
2) 液氮研磨法（適用于復(fù)雜，易降解樣品）：取適量新鮮植物組織放入含液氮的研缽中，迅速將組織研磨成粉末后，將粉末轉(zhuǎn)移到合適的塑料離心管中，加入1 mL溶液A，立即劇烈振蕩20秒，充分混勻。
注意：溶解溶液A沉淀。溶液A在4℃放置后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，使用前必須放在65℃水浴使沉淀徹底溶解并充分搖勻后再取用。
3. 將勻漿物或液氮研磨物轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL塑料離心管中(可以不必轉(zhuǎn)移非液體的細(xì)胞碎片)。有的植物組織（比如果實(shí)）含有大量水份，勻漿液會(huì)多于1 mL，轉(zhuǎn)移時(shí)也只取1 mL。
4. 在離心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自備氯仿，在振蕩器上振蕩30秒混勻，此時(shí)溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時(shí)必須使管底溶液震蕩起來。
5. 室溫12000-15000 g離心3-5分鐘，兩相間將有約5-10毫米厚的細(xì)胞破碎物。
6. 將上清液(約0.6 mL)轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5 mL塑料離心管中，下層有機(jī)相和中間層含有DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，避免觸及或吸取。*好留下100 uL上清液不取。
7. 加入等體積的溶液C，充分顛倒混勻。如果有沉淀產(chǎn)生（對(duì)某些植物，屬于正常現(xiàn)象），千萬不要去掉沉淀，一定要把所有的混合物上柱。
8. 將一半的溶液（如果有沉淀，則先混勻）轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，13000-15000 g室溫離心半分鐘，棄穿透液。
9. 將剩下的一半溶液（如果有沉淀，則先混勻）轉(zhuǎn)移到同一離心吸附柱中， 13000-15000 g室溫離心半分鐘，棄穿透液。
10. 加0.7 mL通用洗柱液，室溫離心半分鐘，棄穿透液。再加0.3 mL通用洗柱液，室溫離心半分鐘，棄穿透液。一般樣品如此洗滌兩次即可，但如果在第7步加入溶液C后有沉淀產(chǎn)生，則需要洗三次，每次加入的通用洗滌液的量分別為0.4、0.3和0.3 mL。
11. 室溫離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留的乙醇會(huì)影響RNA的使用。
12. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到RNase-free收集管中，加入50-100 uL RNA洗脫液，室溫放置1-2分鐘。
13. 13000-15000 g室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
14. RNA完整性的電泳檢測(cè)：如果需要做Northern雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行RNA電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。
15. RNA產(chǎn)量產(chǎn)率測(cè)定：將5-10 μL RNA溶于TE緩沖液中(pH7.5-8.2之間)檢測(cè)其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出RNA濃度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出RNA的產(chǎn)量（濃度X體積)和產(chǎn)率(RNA產(chǎn)量/組織用量)。
16. RNA純度測(cè)定：無污染的總RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之間(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān))，高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)污染，但一般不影響RT-PCR等反應(yīng)。
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