產(chǎn)品及特點

本產(chǎn)品是基于熒光染料檢測的即用型PCR試劑盒，可以對基因組DNA靶序列和RNA反轉(zhuǎn)錄后cDNA靶序列進行實時定量PCR分析（quantitative PCR、qPCR）。本產(chǎn)品含有經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液組分、優(yōu)化的Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、SYBR Green I和穩(wěn)定劑等成分。本產(chǎn)品中優(yōu)化的Taq DNA Polymerase高溫加熱前，抗Taq 單克隆抗體與Taq結(jié)合，抑制Taq聚合酶活性，從而抑制在低溫條件下出現(xiàn)的由引物和模板DNA之間的非特異性雜交或引物二聚體引起的非特異性擴增。而且抗體在PCR反應的預變性步驟中能完全失活，不會阻礙之后Taq DNA聚合酶的活性，大大提高了 PCR 反應的靈敏度及特異性。

1. 方便，用戶只需準備模板和引物既可以進行實時定量PCR實驗和HRM（High Resolution DNA Melt Curve Analysis）分析。而基于SYBR Green I和LC Green染料的qPCR mix則不能同時用于上述兩種實驗。

2. 使用抗Taq抗體封閉的優(yōu)化的Taq DNA聚合酶，可抑制低溫條件下的非特異性擴增。

3. 使用第三代飽和型熒光染料，信號強，不會抑制PCR反應。

4. 快捷，即用型的預配液使加樣操作步驟大大簡化，避免了交叉污染，降低實驗誤差。

5. 各成分的濃度和比例都經(jīng)過精心優(yōu)化，反應的靈敏度高，特異性強。能檢測到濃度為50拷貝/mL的靶分子。

規(guī)格及成分

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存, 保存期限為6個月。

自備試劑

DNA模板、引物、超純水。

使用方法

1. 以20 uL的qPCR反應體系為例：在一干凈的PCR管中，加入下列成分：

放入熒光PCR儀中進行擴增, 并在退火或延長步驟中記錄熒光信號。

注意：

a) 通常引物濃度以0.2 μM可得到較好結(jié)果，可以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考；通常DNA模板的量以10-100 ng基因組DNA或1-10 ng cDNA為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同，可對模板進行梯度稀釋，以確定*佳的模板使用量。

b) ROX 校正染料：如果使用ABI公司的7500，7700和7900三種型號的熒光PCR儀器，則需用自備的ROX進行Ct值校正。對ABI 7700和7900，ROX的*佳濃度為1×（即在每20 uL 反應體系中加2 uL 10×ROX）。對ABI 7500， ROX的*佳濃度為0.05-0.1×（每20 uL 反應體系加0.1-0.2 uL 10×ROX；也可將10×ROX稀釋到1×，然后每個反應體系加入1-2 uL 1×ROX）。ROX會在溶解曲線中產(chǎn)生噪音，因此，如果出現(xiàn)了雜峰，將軟件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”選項取消打勾，然后重新分析數(shù)據(jù)。

對于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000，RotorGene 6000 和 LightCycler 480等型號的熒光PCR儀器，ROX不是必須的，但加入的話也不會影響整個PCR分析。

2. 循環(huán)步驟：根據(jù)擴增子的性質(zhì)和儀器性能，從以下三個過程中任選一個進行擴增。

A：兩步快速循環(huán)法：適用于引物Tm值設計為60℃的反應

注意：本產(chǎn)品所采用的熱啟動酶須在預變性95℃、10 min條件下實現(xiàn)酶的活化。退火溫度請以60-64℃作為設定范圍的參考，發(fā)生非特異性反應時，可提高退火溫度。

B：三步快速循環(huán)法：適用于延伸步驟溫度高于退火步驟的PCR（長引物PCR）

注意：

a) 退火溫度：建議采用兩步法PCR，退火溫度60℃進行反應。若提高反應特異性，可提高退火溫度，以60-64℃作為設定范圍的參考。若因使用Tm值較低的引物等原 因，得不到良好的實驗結(jié)果時，可嘗試進行三步法PCR擴增，三步法的退火溫度請以56℃-64℃的范圍作為設定參考。延伸溫度：延伸溫度設為72℃通常可以提高擴增效率。但是，對于AT含量大于70%的擴增子來說，延伸溫度設為60℃為宜。

C：通用循環(huán)法：這種循環(huán)方法適用于幾乎所有的熒光PCR儀，也適用于用快速循環(huán)法不能擴增的模版。

3. 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在沒結(jié)合DNA時，*大吸收光譜在471nm，結(jié)合DNA時的*大吸收光譜在500nm，*大發(fā)射光譜在530nm。

其他注意事項：

1. 如果使用iCycler，可以不加入FAM。

2. 如果使用Roche LightCycler的玻璃毛細管進行PCR，需加入終濃度為0.5mg/mL的自備BSA。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

即用型PCR2.0、PCR級綠如藍染料。