王亞琦
中南大學(xué)
摘要：**(asthma)是以AHR、上皮結(jié)構(gòu)性損傷、氣道慢性炎癥等為臨床表型和病理特征的呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)**,表現(xiàn)為呼吸道對(duì)一般性理化刺激或**、內(nèi)源性**或炎癥介質(zhì)等過(guò)度反應(yīng),對(duì)病原微生物及毒性氣體的抵抗力降低,易發(fā)生氣道阻力增高和反復(fù),**的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚,公認(rèn)的有**反應(yīng)失平衡和過(guò)敏原學(xué)說(shuō)、神經(jīng)源性氣道炎癥理論及氣道上皮缺陷等。早期的研究顯示,**病人氣道上皮的病理改變與**的局部**炎癥反應(yīng),氣道重構(gòu)及糖皮質(zhì)**的**效果等密切相關(guān)。歐洲呼吸病雜志(Journal of European Respiration)多次明確將**歸類于一類氣道上皮性**?！度蛑夤?*防治倡議》(Global Initiative for Asthma,GINA)明確指出,支氣管上皮功能**在**發(fā)病機(jī)理中的作用和Ig E介導(dǎo)的機(jī)制同等重要,應(yīng)予關(guān)住。本室前期研究應(yīng)用基因芯片篩選了人外周血白細(xì)胞差異表達(dá)的粘附分子,發(fā)現(xiàn)integrin04在**病人中表達(dá)下調(diào)。Toll樣受體1是單個(gè)的跨膜非催化蛋白,是天然**與獲得性**的橋梁,參與急性炎癥與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),TLRs可以識(shí)別多種微生物源的分子,即病原體相關(guān)分子模式,通過(guò)誘導(dǎo)編碼細(xì)胞因子基因,如TNF-α和IFN-β轉(zhuǎn)錄而激活炎癥。其中,TLR4具有普遍適用性。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明了integrin β4在**病人的氣道粘膜表達(dá)降低,同時(shí)發(fā)現(xiàn)沉默integrin β4影響了HBECs的抗原提呈過(guò)程,使得上皮細(xì)胞激活Thl通路受到抑制。我們猜想integrin β4沉默可能影響Toll樣受體在氣道上皮的表達(dá),從而進(jìn)一步與氣道局部的**失平衡密切相關(guān)。因此,本課題將主要研究integrin β4沉默對(duì)HBECs中TLR4表達(dá)及TLR4下游兩條重要信號(hào)通路的影響。目的：觀察integrin β4沉默對(duì)HBECs中TLR4表達(dá)的影響,及TLR4下游兩條重要信號(hào)通路的影響。同時(shí),研究integrin β4對(duì)誘導(dǎo)**細(xì)胞分化的作用,以及由此引起**失平衡,從而對(duì)引起**發(fā)病的**學(xué)理論進(jìn)行初步的探討。方法：(1)設(shè)計(jì)并合成integrin β4siRNA,并將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HBECs中。通過(guò)熒光顯微鏡觀察siRNA的轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別從RNA和蛋白水平檢測(cè)integrin β4的表達(dá)。(2)MTT法確定LPS的*佳給藥濃度。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),在LPS作用下,正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組TLR4的改變。(4) Western blot法檢測(cè),在LPS作用下,正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組MyD88, TRIF的改變,反映integrin β4分別對(duì)TLR4下游分子的影響。(5)ELISA法檢測(cè),在LPS分別作用24h,48h,72h后,正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組中TNF-α, IFN-β的改變,進(jìn)一步檢測(cè)integrin β4分別對(duì)TLR4兩條信號(hào)通路的影響。(6)正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組,分別受LPS刺激6h,與**細(xì)胞共培養(yǎng)72h,收集細(xì)胞上清液,ELISA法檢測(cè)IFN-γ, IL-4,IL-17分泌量,觀察integrin β4對(duì)誘導(dǎo)**細(xì)胞分化的影響。結(jié)果：(1)成功合成integrin β4siRNA,并轉(zhuǎn)染]HBECs。熒光顯微鏡下觀察,siRNA的轉(zhuǎn)染效率為90%。與Control siRNA組相比,轉(zhuǎn)染integrin β4siRNA的HBECs中,integrin β4在mRNA水平及蛋白水平表達(dá)均顯著下降(2)LPS作用HBECs的*佳給藥濃度為1μg/mL。(3)LPS刺激使得HBECs中TLR4的表達(dá)顯著升高。與Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組在LPS作用下,TLR4的表達(dá)升高更明顯。(4)LPS刺激使HBECs中MyD88, TRIF的表達(dá)顯著升高。與Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組在LPS作用下,MyD88, TRIF的增加趨勢(shì)更明顯。(5)LPS刺激使HBECs中TNF-α和IFN-β的表達(dá)顯著升高。與Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組在LPS作用下,TNF-α和IFN-β的增加更明顯。與**細(xì)胞共培養(yǎng)24h,48h,72h TNF-α的分泌量變化不明顯,然而IFN-β的分泌量在24h,48h升高不明顯,72h時(shí)明顯增高。(6)較正常HBECs組和Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組可以明顯升高與之共培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞對(duì)IL-4,IL-17的分泌,對(duì)IFN-γ的分泌量無(wú)明顯變化。在LPS作用下,LPS組較LPS陰性組相比,IFN-γ的分泌量明顯升高,IL-4和IL-17的分泌量無(wú)明顯差異。結(jié)論：(1)通過(guò)RNA干擾技術(shù)能有效沉默integrin β4,成功構(gòu)建integrin β4細(xì)胞模型。(2)靶向沉默integrin β4可以明顯促進(jìn)TLR4的表達(dá),激活TLR4下游兩條信號(hào)通路,同時(shí)對(duì)MyD88依賴信號(hào)通路激活發(fā)24h,對(duì)MyD88非依賴信號(hào)通路激活發(fā)生在72h。(3)靶向沉默integrin β4促進(jìn)CD4+T**細(xì)胞向Th2方向分化,平衡向Th2方向漂移,同時(shí),誘導(dǎo)Th17型炎癥發(fā)生。LPS在給藥濃度為1μg/mL時(shí),可以誘導(dǎo)Thl型**發(fā)生。
關(guān)鍵詞：**; 支氣管上皮細(xì)胞; 整合素β4; TOll樣受體4;
導(dǎo)師：秦曉群; 劉持;
分類號(hào)：R562.25