烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的影響及作用機(jī)制初步探討

血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular Endothelial Cell,VEC)為裱襯于整個(gè)心血管系統(tǒng)內(nèi)表面的單層扁平鱗狀細(xì)胞,是血管壁與血液之間的分界,是形成心血管封閉系統(tǒng)的形態(tài)基礎(chǔ)和血管通透性的主要屏障,能維持血液的正常流動(dòng)狀態(tài),并將血管內(nèi)外分開,調(diào)節(jié)血管內(nèi)外的物質(zhì)交換,起到屏障作用。Ley等(1995)的試驗(yàn)研究認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞還是一個(gè)活躍的代謝及***器官,可分泌多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子,如前列腺素(PGs)、血栓素A2(TXA2)、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-a)、粘附因子(ICAM-1)、E-選擇素(E-selecting)、 P-選擇素(P-selectin)、生長(zhǎng)因子等,并能激活NF-KB(nuclear factor),在機(jī)體組織的凝血與抗凝血、**應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的調(diào)控等方面均起著重要作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞在人體的多種生理和病理過程中均發(fā)揮著重要作用,是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)課題,而其中研究較為深入的內(nèi)容之一就是人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,相對(duì)于其他血管內(nèi)皮細(xì)胞而言,人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞具有干細(xì)胞的潛能,并且具有取材容易、來源充足以及操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn),同時(shí)體外獲得的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞混雜細(xì)胞較少,與各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞相比較,更接近人體內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn),是體外研究常用血管內(nèi)皮細(xì)胞之一。嚴(yán)重**時(shí),機(jī)體釋放出大量的炎癥介質(zhì),如TNF-α、內(nèi)**、IL-1β、IL-6等,而血管內(nèi)皮細(xì)胞由于其解剖地位決定其極易成為各種炎癥介質(zhì)作用的靶細(xì)胞。烏司他丁(Ulinastatin,UTI)是一種從人尿中提取的精制糖蛋白,其分子量為67000D,由143個(gè)氨基酸殘基組成,其生物利用度為100%,半衰期4Omin,5min達(dá)峰值,屬于人內(nèi)源性的蛋白酶抑制劑。烏司他丁不僅可以通過抑制多種蛋白、糖和脂類的水解酶的活性,起到抑制炎癥介質(zhì)的過度釋放,改善微循環(huán)和組織灌注等重要的藥理作用,從而減少炎性損傷因子等對(duì)機(jī)體的損傷,維持人體內(nèi)環(huán)境平衡。同時(shí),烏司他丁還具有穩(wěn)定溶酶體膜,抑制溶酶體酶的釋放,抑制心肌抑制因子的產(chǎn)生,**氧自由基的作用。另外,烏司他丁還可一系列作用抑制血小板釋放活性物質(zhì)、維護(hù)血小板正常聚集功能、維護(hù)血管正常舒縮功能以及維護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞完整性。部分基礎(chǔ)和臨床研究顯示UTI可以減少****滲漏,減輕組織水腫,具有一定的血管內(nèi)皮保護(hù)作用,因此臨床上常被用于嚴(yán)重**、急性胰腺炎、急性肺損傷、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)等**。有研究顯示,人血漿內(nèi)存在較高濃度的蛋白酶抑制劑,當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重?fù)p傷如感染、發(fā)熱、腫瘤、妊娠、休克、手術(shù)或給予糖皮質(zhì)**等刺激時(shí),這種蛋白酶抑制劑會(huì)被消耗,濃度出現(xiàn)明顯下降,但是隨機(jī)體的逐漸恢復(fù),其濃度又會(huì)逐漸上升,而人體尿液中的UTI活性升高。因此,烏司他丁具有抵抗外來刺激,減少外界損傷因子對(duì)機(jī)體的損傷,維持人體內(nèi)環(huán)境平衡的作用。既往較多研究結(jié)果已證實(shí),烏司他丁對(duì)**和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用,但是關(guān)于烏司他丁是否能影響細(xì)胞增殖、凋亡等生理活動(dòng)則鮮有報(bào)道。ERK通路作為MAPK家族中*先被發(fā)現(xiàn)并被研究*多的成員,被認(rèn)為與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和分化相關(guān),其包括了兩種異構(gòu)體ERK1和ERK2(分別為P44和P42)。ERK分子內(nèi)被兩個(gè)磷酸化受體位點(diǎn)即酪氨酸和蘇氨酸被谷氨酸殘基分隔開來,故其磷酸化位點(diǎn)基序是TEY。ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括典型的3個(gè)層次MAPKs的序貫激活過程。Raf蛋白(MAPKKK)的激活能磷酸化MEK1/2(MAPKK),并使后者激活,從而使隨后的ERK1/2(MAPK)發(fā)生雙重磷酸化而被緝獲。ERK的激活對(duì)于Ras誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子(如Elk1、cEts1和c—Ets2)的激活以及激酶(如P90rsk1、MNK1和MNK2)的激活是至關(guān)重要的。目前,較多臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)已證明,烏司他丁能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,減少炎癥介質(zhì)的釋放,但是否具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,加快受損血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù),縮短血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)的時(shí)間,進(jìn)而減少血管內(nèi)液的滲漏等功能仍鮮有報(bào)道。由于在機(jī)體全身炎癥反應(yīng)過程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞所處位置和具有的功能決定了其成為環(huán)境刺激因素與生物學(xué)行為之間的中介,是內(nèi)源性**和外源性干預(yù)因素的作用靶細(xì)胞。因此本實(shí)驗(yàn)以血管內(nèi)皮細(xì)胞作為研究烏司他丁的切入點(diǎn),通過加入不同濃度梯度的烏司他丁,使用目前常用的方法進(jìn)行檢測(cè),觀察不同濃度的烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮的增殖、凋亡、遷移、粘附功能的作用,然后再加入**血清和ERK通路抑制劑,進(jìn)一步觀察在炎癥狀態(tài)下烏司他丁是否仍有促進(jìn)增殖的作用,并初步探究該作用與ERK通路的相關(guān)性。烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的影響及作用機(jī)制初步探討目的觀察不同濃度的烏司他丁溶液對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、粘附作用的影響,以及與ERK1/2通路的相關(guān)性。方法購買進(jìn)口的經(jīng)鑒定的原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,從液氮取出后經(jīng)37℃水浴復(fù)蘇人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞后,將細(xì)胞置于離心機(jī)離心,然后將細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿內(nèi),置于二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行時(shí)培養(yǎng),隔日換液,待鏡下細(xì)胞融合80%左右時(shí),加入胰酶進(jìn)行消化,2分鐘后鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,邊緣略變圓、彼此分離或呈大片狀分離,加入完全培養(yǎng)基終止消化,然后將細(xì)胞按照1:2-1:3傳代培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),選擇生長(zhǎng)狀態(tài)較好的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組U組和實(shí)驗(yàn)組A組(625單位/ml)、B組(2500單位／ml)、C組(5000單位/ml)、D組(10000單位/ml),收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,接種于6孔板內(nèi),37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細(xì)胞在6孔板中生長(zhǎng)至50-60%時(shí),用celltrac e實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的影響；按照TUNEL實(shí)驗(yàn)的說明步驟進(jìn)行操作,檢測(cè)不同濃度烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用的影響；進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),分別在0h,6 h,24h,48h的時(shí)間點(diǎn)采集圖片和數(shù)據(jù),計(jì)算遷移率,檢測(cè)不同濃度烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移作用的影響；進(jìn)行細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn),以BSA組貼壁細(xì)胞OD值為參照,計(jì)算matrigel和FN組細(xì)胞貼壁率,檢測(cè)不同濃度烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附作用的影響。再次培養(yǎng)細(xì)胞,將細(xì)胞隨機(jī)分為四組,對(duì)照組ck為正常人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組a為正常人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞加入**血清,實(shí)驗(yàn)組b為正常人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞加入**血清和烏司他丁(5000單位/ml),實(shí)驗(yàn)組c為正常人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞加入ERK1/2通路抑制劑、**血清、烏司他丁(5000單位/ml),用celltrace實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度烏司他丁對(duì)各組人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的影響。對(duì)數(shù)據(jù)行單因素方差分析(One-way ANOVA)、LSD-t檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。結(jié)果1.不同濃度烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的影響與對(duì)照組相比較,烏司他丁濃度分別為625u/ml、2500u/ml、5000u/ml、10000u/ml的四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞均有增殖,當(dāng)**濃度為5000u/ml時(shí)細(xì)胞增殖活動(dòng)*明顯,但是當(dāng)濃度達(dá)到10000u/ml時(shí),細(xì)胞的增殖活動(dòng)較**濃度為5000u/ml的實(shí)驗(yàn)組有所減弱。2.不同濃度烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用的影響與對(duì)照組相比較,烏司他丁濃度分別為625u/ml、2500u/ml、5000u/ml時(shí)細(xì)胞并未出現(xiàn)明顯凋亡,當(dāng)**濃度達(dá)到10000u/ml時(shí),凋亡的細(xì)胞明顯增加。3.不同濃度烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移作用的影響對(duì)照組、烏司他丁濃度分別為625u/ml、2500u/ml、5000u/ml、10000/ml的實(shí)驗(yàn)組6h的遷移率分別為4.08±0.01、2.61±0.03、7.24±0.02、3.99±0.04、22.07±0.02,24h的遷移率分別12.53±0.11、13.044±0.03、20.65±0.02、21.37±0.07、30.10±0.02,48h的遷移率分別為20.18±0.04、25.00±0.06、37.92±0.10、49.22±0.07、49.01±0.03,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)的遷移率與對(duì)照組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4.不同濃度烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附作用的影響以BSA作為參照,測(cè)得對(duì)照組和烏司他丁濃度分別為625u/ml、2500u/ml、5000u/m1、10000u/ml的實(shí)驗(yàn)組粘附率分別為38±0.002、39±0.003、41±0.008、43±0.004、43±0.012,用纖維粘連蛋白(FN)測(cè)得的粘附率分別60±0.006、61±0.008、644±0.002、73±0.002、81±0.03,用基質(zhì)膠(matrigel)測(cè)得的粘附率分別為50±0.110、51±0.009、544±0.001、61±0.100、66±0.003,**濃度為625u/ml的實(shí)驗(yàn)組的粘附率與對(duì)照組相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),**濃度分別為2500u/ml、5000u/ml、10000u/ml時(shí)的實(shí)驗(yàn)組的粘附率與對(duì)照組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5.烏司他丁對(duì)加入**血清和ERK通路抑制劑的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的影響,以及與ERK通路的相關(guān)性與對(duì)照組相比較,**血清組的正常人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活動(dòng)受到抑制,而**血清加濃度為5000u/ml烏司他丁的實(shí)驗(yàn)組中,人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)增殖,另外,在**血清加濃度為5000u/ml烏司他丁和ERK1/2通路抑制劑UO126的實(shí)驗(yàn)組中,人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)增殖,但其增殖活動(dòng)較對(duì)照組稍有減弱。1.不同濃度的烏司他丁能促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用,并且與濃度呈正相關(guān),當(dāng)**濃度為5000U/ml時(shí),烏司他丁的促增殖作用達(dá)到高峰。2.低、中濃度的烏司他丁對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡無影響,但是物濃度為10000U/ml的烏司他丁可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡3.不同濃度的烏司他丁能促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用,該作用與濃度呈正相關(guān)。4.不同濃度的烏司他丁能促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用,并且該作用與濃度呈正相關(guān)。5.ERK1/2通路參與了烏司他丁的促增殖作用,但并非**途徑,烏司他丁可能通過其他信號(hào)通路共同影響細(xì)胞的增殖活動(dòng)。