蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)殘快速檢驗(yàn)法——酶抑制率法(分光光度法)
實(shí)驗(yàn)原理
根據(jù)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥能抑制乙酰膽堿酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反應(yīng)底物碘化乙酰硫代膽堿和乙酰膽堿酯酶，如果蔬菜不含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留或殘留量低，酶的活性就不被抑制，實(shí)驗(yàn)中加入的底物就能被酶水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)。如果蔬菜的提取液含有農(nóng)藥并殘留量較高時(shí)，酶的活性被抑制，底物就不被水解，當(dāng)加入顯色劑時(shí)就不顯色或顏色變化很小。用分光光度計(jì)在412nm處或農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀測(cè)定吸光值，根據(jù)計(jì)算出的抑制率，就可以判斷蔬菜中含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的情況。
實(shí)驗(yàn)試劑
1. pH8.0緩沖液 分別稱取11.9g無(wú)水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，溶解于1000 mL蒸餾水中。
2. 乙酰膽堿酯酶(實(shí)驗(yàn)專用酶) 根據(jù)酶活力用緩沖溶液溶解，3 min的吸光值變化ΔA0值應(yīng)控制在0.3以上。搖勻后在0~5℃冰箱中保存，保存期不超過4天。
3. 底物碘化乙酰硫代膽堿 稱取25.0 mg碘化乙酰硫代膽堿，用3.0 mL緩沖溶液溶解，在0~5℃下保存。保存期不超過2周。
4. 顯色劑 分別稱取160 mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6 mg碳酸氫鈉，用20 mL緩沖溶液溶解，4℃冰箱保存。
5. 可選用由以上試劑配置的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的ΔA0值應(yīng)控制在0.3以上。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 分光光度計(jì)或相應(yīng)的農(nóng)殘快速檢測(cè)儀；
2. 天平(0.01g)；
3. 恒溫水浴或恒溫培養(yǎng)箱。
實(shí)驗(yàn)材料
待測(cè)果蔬
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 樣品處理
選取有代表性的蔬菜樣品，去掉不可食部分后稱取蔬菜試樣，沖洗掉表面泥土，剪成1 cm左右碎片。取樣品1 g，放入燒杯或提取瓶中，加入5 mL緩沖液，振蕩1~2 min，倒出提取液，靜置3~5 min，待用。
2. 對(duì)照溶液測(cè)試
先于試管中加入2.5 mL緩沖液，再加入0.1 mL酶液、0.1 mL顯色劑。搖勻后于37 ℃放置15 min以上(每批樣品的控制時(shí)間應(yīng)一致)。加入0.1 mL低物搖勻，此時(shí)檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入比色皿中，記錄反應(yīng)3 min的吸光度的變化值ΔA0。
3. 樣品溶液測(cè)定
先于試管中加入2.5 mL樣品提取液，其他操作與對(duì)照測(cè)定相同，記錄反應(yīng)3 min的吸光度的變化值ΔAt。
4. 結(jié)果計(jì)算：
抑制率(%)=
式中 ΔA0——對(duì)照液反應(yīng)3 min吸光度的變化值；
ΔAt——樣品溶液反應(yīng)3 min吸光度的變化值。
5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷：
當(dāng)蔬菜樣品提取液對(duì)酶的抑制率大于50% 時(shí)，表示樣品中有高劑量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留，可判定樣品為陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性的樣品需重復(fù)檢驗(yàn)兩次以上。
檢驗(yàn)結(jié)果記錄：
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樣品名稱
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ΔA0
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ΔAt
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抑制率(%)
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檢驗(yàn)結(jié)果
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注意事項(xiàng)
1. 對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性的樣品，需用其他方法進(jìn)一步確定殘留農(nóng)藥的種類和進(jìn)行定量測(cè)定。
2. 酶抑制率法對(duì)部分農(nóng)藥的檢出限為：
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農(nóng)藥名稱
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檢出限(mg/kg)
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農(nóng)藥名稱
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檢出限(mg/kg)
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敵敵畏
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0.1
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氧化樂果
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0.8
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對(duì)硫磷
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1.0
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甲基異柳磷
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5.0
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辛硫磷
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0.3
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滅多威
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0.1
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甲胺硫
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2.0
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丁硫克百威
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0.05
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馬拉硫磷
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4.0
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敵百蟲
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0.2
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樂果
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3.0
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呋喃丹
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0.05
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3. 蔥、蒜、蘿卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，處理樣品時(shí)，可采取整株(體)蔬菜浸提或采用表面測(cè)定法。對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株(體)蔬菜浸提法，減少色素的干擾。
4. 當(dāng)溫度條件低于37℃，酶反應(yīng)速度隨之放慢，藥片加液后放置反應(yīng)的時(shí)間也應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng)，延長(zhǎng)時(shí)間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對(duì)照測(cè)試的吸光度變化
ΔA0在0.3以上為準(zhǔn)。注意樣品放置時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照溶液放置時(shí)間一致才有可比性。酶的活性不夠和溫度太低都可能造成膽堿酯酶空白對(duì)照液3 min的吸光度ΔA0變化值＜0.3。
5. 該法適用于大量蔬菜樣本的篩檢，不適用于*后的仲裁檢測(cè)。