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下面的操作步驟是針對在1.5 mL塑料離心管中進(jìn)行的微量提取的，如果處理樣品量大，請按比例增加各成份的用量并使用大的離心管和離心機(jī)。
1. 根據(jù)組織細(xì)胞類型的不同分為下面及種情況使用：
a) 對貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，在每10平方厘米細(xì)胞中加入1 mL溶液A，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解。
b) 對懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，在每1-5×106懸浮細(xì)胞中加入1 mL溶液A，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1 mL溶液A的細(xì)胞使用量不要超過1×106個(gè)細(xì)胞。
c) 對新鮮組織：先將剪切成小塊新鮮組織或液氮保存的組織放入10 mL或15 mL塑料離心管中，每50-100 mg組織加1 mL溶液A，用勻漿器勻漿30秒左右。對肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織（細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的DNA），建議組織的使用量不要超過50 mg/ mL溶液A，否則十分容易產(chǎn)生DNA污染。
d) 對RNALOCKER保存組織：先用紙吸去RNALOCKER液體后再剪切成小塊，其余操作同新鮮組織的處理。
2. 將裂解物轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的1.5 mL塑料離心管中，然后加入0.2倍體積的自備氯仿(1 mL溶液A需0.2 ml氯仿)，振蕩器上充分振蕩混均30秒。
3. 12,000 rpm室溫離心3-5分鐘。
4. 將上清液（約0.6-0.8 mL的無色透明水相，有時(shí)水相比重大時(shí)，水相在下層，有機(jī)相即藍(lán)相在上層，吸取時(shí)應(yīng)吸取透明水相）轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的1.5 mL塑料離心管中。注意：離心后下層有機(jī)相和中間層含有DNA和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和DNA污染。為保險(xiǎn)起見，可以留下100 uL上清液不取。同時(shí)吸取上清時(shí)*好緩慢進(jìn)行，否則容易吸出交界面的不可見的絲狀DNA。
5. 加入等體積的溶液B，充分顛倒混勻。
6. 將一半的溶液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，12,000 rpm室溫離心半分鐘，棄穿透液。
7. 將剩下的一半溶液轉(zhuǎn)移到同一離心吸附柱中， 12,000 rpm室溫離心半分鐘，棄穿透液。
8. 加0.7 mL通用洗柱液到離心吸附柱中，室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。一次洗滌一般足夠去除雜質(zhì)。
9. 加0.3 mL通用洗柱液，室溫離心半分鐘，棄穿透液。此步可以省略。
10. 室溫12,000 rmp離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留的通用洗柱液會影響RNA的使用。
11. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的RNase-free收集管中，加入50-100 uL RNA洗脫液。
12. 室溫12,000 rmp離心半分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
13. RNA的電泳檢測：本試劑盒提取的RNA*好用甲醛變性膠電泳，如果在非變性的普通瓊脂糖膠（in TAE或TBE buffer）上電泳，一定要使用RNA專用上樣液RNAon（操作詳見RNAon使用手冊），千萬不要使用常用的DNA上樣液，因?yàn)镈NA上樣液沒有經(jīng)過去RNase處理，也不能將RNA變性，得到的帶型將十分雜亂。
14. RNA完整性的電泳檢測：如果需要做Northern雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行RNA電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。
15. RNA產(chǎn)量產(chǎn)率測定：將5-10 μL RNA溶于TE緩沖液中(pH7.5-8.2之間)檢測其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出RNA濃度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出RNA的產(chǎn)量（濃度X體積)和產(chǎn)率(RNA產(chǎn)量/組織用量)。
16. RNA純度測定：無污染的總RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之間(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān))，高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)污染，但一般不影響RT-PCR等反應(yīng)。
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