如何制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞？

你知道如何制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞嗎？今天小編就跟大家講解下氯化鈣法。

摘要

本文建立一種高效、快速的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的方法.方法:質(zhì)粒DNA加入感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)短暫冰浴和熱休克后,直接涂布預(yù)熱至37℃的平板.

原理

帶有外源DNA的重組質(zhì)粒，在體外構(gòu)建后，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，隨著細(xì)胞的大量復(fù)制、繁殖，才能夠有機(jī)會(huì)獲得純的重組質(zhì)粒 DNA，該過程稱之為轉(zhuǎn)化過程。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化學(xué)試劑）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許外源 DNA 的載體分子通過。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 從 37 ℃ 培養(yǎng) 16～20 h 的平板中挑取一個(gè)單菌落（直徑 2～3 mm），轉(zhuǎn)到一個(gè)含有 100 ml LB 或 SOB 培養(yǎng)基的 1L 燒瓶中。于 37℃ 劇烈振搖培養(yǎng) 3 h。一般經(jīng)驗(yàn)，1 OD600 約含有大腸桿菌 DH5α 109 個(gè)/mL。

2. 將**轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置 10 min，使培養(yǎng)物冷卻至 0℃。

3. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 特頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以 4 100 r/min 離心 10 min，以回收細(xì)胞。

4. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置 1 min 以使*后的痕量培養(yǎng)液流盡。

5. 每 50 ml 初始培養(yǎng)液用 30 ml 預(yù)冷的 0.1 mol/LCaCl2-MgCl2 溶液（80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2） 重懸每份細(xì)胞沉淀。

6. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以 4 100 r/min 離心 10 min，以回收細(xì)胞。

7. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置 1  min 以使*后的痕量培養(yǎng)液流盡。

8. 每 50 ml 初始培養(yǎng)物用 2 ml 用冰預(yù)冷的 0.1 mol/L CaCl2（或 TFB） 重懸每份細(xì)胞沉淀。

9. 此時(shí)，可以用新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞直接做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可以將細(xì)胞凍存于- 70 ℃。